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EvaGreen qPCR 染料

適于qPCR 和 HRM 最佳（沒有之一）熒光染料

     EvaGreen 是一種用于實(shí)時(shí)定量 PCR （ qPCR ）的 DNA 結(jié)合染料。該染料的諸多優(yōu)點(diǎn)使它遠(yuǎn)勝于 SYBR Green I 。除了有相似的光譜特性， EvaGreen 有三個(gè)主要特點(diǎn)使它區(qū)別于 SYBR Green I 。

    首先， EvaGreen 對(duì) PCR 的抑制性遠(yuǎn)小于 SYBR Green I 。因此，使用 EvaGreen 進(jìn)行的 qPCR 實(shí)驗(yàn)可以使用快速 PCR 步驟。同時(shí)， EvaGreen 在實(shí)驗(yàn)中可以使用較高的濃度，從而獲得遠(yuǎn)強(qiáng)于 SYBR Green I 擴(kuò)增信號(hào)（圖 3）。較高濃度的 EvaGreen 也消除了“染料重分布”的缺陷，使 EvaGreen 既可用于多重 PCR ，也可用于高分辨率（高清晰）熔解曲線分析（ HRM ）（圖 4 ）。該分析正被越來越多的用于 PCR 后的基因分型和異源雙鏈分析 。由于 SYBR Green I 對(duì) PCR 的抑制性，從而要求其使用濃度必須很低，因此 SYBR Green I 無法解決由低濃度造成的染料重分布問題，既不能用于多重 PCR 也不能用于 HRM 。同時(shí)，染料重分布問題也可能影響常規(guī)熔解曲線的可靠性，因?yàn)榈腿埸c(diǎn)的 DNA 鏈可能由于這種原因而無法檢測(cè)到 。

    第二， EvaGreen 的穩(wěn)定性極好。在正常的儲(chǔ)存、操作和 PCR 過程中不會(huì)被破壞。在緩沖溶液中的染料可以安全的儲(chǔ)存在室溫或冰箱里，也可以反復(fù)凍融。與之相反， SYBR Green I 不穩(wěn)定而且降解后對(duì) PCR 抑制性更強(qiáng) 。

    EvaGreen 降低了細(xì)胞膜透性，因而比 SYBR Green 1 更加安全。獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室的測(cè)試結(jié)果顯示， EvaGreen 既沒有誘變性也沒有細(xì)胞毒性 。相反，雖然 SYBR Green I 本身誘變性很弱，但它在細(xì)胞中可能抑制了正常 DNA 的修復(fù)機(jī)制，使其有誘變?cè)鰪?qiáng)作用 。考慮到 PCR 的廣泛使用，其安全性應(yīng)該得到足夠重視。

圖3. 比較Biotium公司的 Fast EvaGreen master mix (green)和 A公司 (blue) 和?Q公司 (red)fast SYBR Green master mixes, 顯示相比 SYBR Green，EvaGreen 有著超級(jí)靈明度。 （ A fragment of ATPG was amplified from varying amounts of human genomic DNA (200 ng to 20 pg) using an ABI 7900 Fast thermocycler.）		圖 4 . 在 Rotor Gene 6000 上使用 EvaGreen 進(jìn)行高分辨率熔解曲線（ HRM ）分析可以明顯的區(qū)分三個(gè)不同的基因型：突變型（紅色）、雜合型（紫色）和野生型（藍(lán)色）。（數(shù)據(jù)由 Corbett Research 提供）
		圖 5 . EvaGreen 在 PBS 緩沖溶液中結(jié)合 dsDNA 后的激發(fā)和發(fā)射光譜

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